Derniers résultats acquis

(Mise à jour mars 2017)

Les objectifs sont (1) de réaliser une veille scientifique afin d’identifier les maladies transmissibles (virus et apparentés) qui pourraient devenir préoccupantes pour la filière viticole française, (2) de développer si besoin des tests adaptés à leur détection et (3) d’évaluer l’intérêt de nouvelles méthodes de détection sur des maladies réglementées ou importantes.

Veille scientifique sur l'émergence de virus et maladies apparentées et développement de tests de détection adaptés

En 2015, l’attention s’est centrée sur 2 agents pathogènes : un virus, le GPgV (Grapevine Pinot Gris Virus) et une bactérie : Xylella fastidiosa, agent de la maladie de Pierce sur vigne. Pour le premier nous avons évalué différentes amorces d’équipes internationales, afin de pouvoir utiliser les amorces les plus universelles Une visite et des contacts ont également été établis avec l’équipe Italienne du centre CREA (Sussegana).
Xylella fastidiosa est un organisme de quarantaine en Europe. Elle est responsable sur vigne de la maladie de Pierce qui a fait d’importants dégâts dans les vignobles Californiens dans les années 1990. En octobre 2013, 2 foyers ont été détecté en Italie sur des oliviers. De par son statut d’organisme de quarantaine, aucune introduction de matériel malade n’est envisageable et il semble donc difficile de pouvoir valider tel ou tel test de détection. Des contacts ont été pris avec le LSV (Angers et Clermont-Ferrand) pour évaluer la possibilité de pouvoir réaliser de tels tests dans leurs laboratoires en conditions de confinement avant toute introduction de matériel venant d’Italie. Par ailleurs, une veille scientifique a été initiée sur le sujet afin de se préparer à son éventuel passage sur vigne.

Développement de nouvelles méthodes sur virus connus et évaluation de l'intérêt de nouvelles techniques pour la détection

La détection des virus peut se faire par différentes méthodes, de type biologique (indexage), ou par des méthodes de détection directe : ELISA et RT-PCR.
Le principal atout de la technique ELISA est sa rapidité qui permet de tester un nombre d’échantillons conséquent en un temps limité. La limite de cette technique reste l’existence de sérums adaptés (sensibilité, spécificité) fournis par des laboratoires spécifiques. Il n’existe ainsi pas sur le marché de sérums pour tous les virus et, quand ils existent, leur efficacité est parfois limitée (cas du GVB et du GRSPaV par exemple).
A contrario, la détection par RT-PCR1 basée sur le développement d’amorces est indépendante des fournisseurs de sérums. Dès que la séquence d’un virus est connue, il est possible, assez rapidement de développer des amorces qui seront utilisées pour sa détection. L’inconvénient de cette technique est qu’elle ne peut, pour l’instant, être utilisée que pour un nombre limité d’échantillons, les premières étapes de préparation et d’extraction des ARN/ADN des virus étant chronophages. L’apparition assez récente de nouvelles machines sur le marché permet d’envisager le développement de tests de détection par RT-PCR à grande échelle en complément ou en remplacement de l’ELISA.

Détection des virus par RT-PCR

Afin de profiter des technologies de dépistage de pointe et pour améliorer la garantie sanitaire des clones, nous avons développé, en complément des tests ELISA, des méthodes de détection par RT-PCR et qRT-PCR.
Ces méthodes plus sensibles sont maintenant disponibles pour la détection des virus impliqués dans l’enroulement (GLRaV 1,-2,-3, 4 like, -7), le Court-Noué (ArMV, GFLV et TBRV), la marbrure (GFkV), le GVA, le GVB, le GRSPaV et certains virus identifiés à l’étranger comme le Red Blotch (GRBaV) identifié en 2011 aux Etats-Unis puis au Canada et le GPgV.

Développement et utilisation des Nanobodies pour la détection des virus impliqués dans le Court-Noué

L’objectif est de disposer d’une analyse plus rapide, potentiellement plus sensible et moins coûteuse que les tests ELISA actuels.
Les nanobodies sont des petits anticorps d’environ 15kDa produits par les Camélidés. Ils pourraient constituer un puissant outil de diagnostic en remplacement des sérums actuellement commercialisés de par leur coût de production réduit et leur sensibilité potentiellement supérieure à celle des anticorps classiques. Ces travaux sont réalisés dans le cadre d’une thèse en collaboration avec l’IBMP de Strasbourg et l’INRA de Colmar.
Les objectifs de cette thèse sont i) d’évaluer le potentiel des Nanobodies (Nb) pour la détection des virus du court-noué ii) de développer un test de type ELISA et iii) à plus long terme de développer un test en bandelettes directement utilisable au vignoble.
La production et la purification a été réalisée ainsi que l’évaluation du spectre de détection sur les collections présentes à Colmar et au Grau du Roi. Restent à optimiser les différentes étapes afin de comparer les performances du test « ELISA Nanobodies » en matière de sensibilité et de spécificité par rapport aux tests commerciaux existants. Si ce test fonctionne, il pourrait ensuite être utilisé pour le suivi de l’état sanitaire des souches dans le cadre de la certification sous réserve de validation par le ministère.

1) RT-PCR : technique de biologie moléculaire permettant l’amplification d’une partie du génome du virus

Vidéo

Xylella Fastidiosa, la crainte d'une émergence 
Présentation de François-Michel Bernard (IFV), à Millésime bio 2016 Voir

 
 
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