Méthodes de caractérisation des souches au laboratoire

Méthodes de caractérisation des souches en laboratoire

Les levures sont identifiées selon KURTZMAN (1998) en utilisant les galeries ID 32C selon CUINIER et LEVEAU (1979).

Phénotype Killer

Le phénotype « killer » des levures est déterminé selon la technique décrite par BARRE (1980). Les levures de référence sont les souches Killer (NCYC 738) et sensible (NCYC 1006)

Biologie moléculaire

Etude réalisée sur la souche d’origine ou, le plus souvent, sur une souche isolée de LSA. Comparaison des levures entre elles par PCR et ECP ( voir chapitre « Identification des micro-organismes).

Production d’écume

La production d’écume est appréciée selon CUINIER et LACOSTE (1980). Le test est réalisé en double pour chaque souche.

Caractérisation sur milieu synthétique

Milieu synthétique n°1 :

Sur milieu synthétique fermenté à 20°C sont déterminés la cinétique fermentaire (temps de latence, allure de la cinétique de fermentation) et après 40 jours de fermentation : rendement sucre/éthanol, sucres résiduels, le pourcentage de dégradation de l’acide malique, l’acidité volatile, SO2, l’acétaldéhyde, l’acide pyruvique, le glycérol.

L’étude est réalisée en double. La souche est repiquée sur malt gélosé incubé 24h à 28°C. Le contenu de deux öses est repiqué sur 40ml de milieu synthétique incubé 64h à 20°C (préculture). 10 ml de préculture sont ensemencés dans 390ml de milieu synthétique, en flacon de 500ml doté d’un tube effilé. La fermentation est conduite à 20°C pendant 40 jours. Les flacons sont agités une fois par jour et pesés. Au bout de 40 jours, le milieu est décanté après réfrigération à 4°C pendant 24 heures minimum et filtré. Sur le filtrat sont dosés :

    • L’éthanol, les sucres résiduels, le SO2, l’acidité volatile,
    • après ajout de 100mg/l de SO2, l’acide malique, l’acétaldéhyde, l’acide pyruvique et le glycérol par méthode enzymatique ( BOEHRINGER).

Composition du milieu synthétique n°1 :

YCB Difco (Yeast Carbon Base) : 11,70 g ; Saccharose : 184,30 g ; Cl NH4 : 1,15 g ; Acide tartrique : 2 g ; Acide L-malique : 5 g ; Eau distillée q.s.p. : 1000 ml

Le pH est ajusté à pH = 3,20

La fraction du milieu destinée à la préculture est stérilisée 15 minutes à 100°C. La fraction utilisée pour la fermentation est filtrée stérilement sur membrane de seuil de rétention absolu de 0,45 µm.
Le milieu ainsi préparé contient l’équivalent de 204 g/l de sucre réducteur, soit 12 % v/v en éthanol probable si le rendement des levures est de 17 g de sucre pour 1 % v/v d’éthanol.

Composition du milieu synthétique n°2 :

Seule la teneur en saccharose varie par rapport au milieu synthétique n°1 : elle est de 249 g/L, soit 16 % v/v en éthanol probable si le rendement des levures est de 17 g de sucre pour 1 % v/v d’éthanol.
Sur ce milieu sont déterminés : le pouvoir alcoogène, les sucres résiduels et l’acidité volatile produite.

Le milieu synthétique n°2 a remplacé le milieu Morgan Harris utilisé auparavant, qui semblait donner des résultats peu reproductibles. Certains résultats signalés par un * ont été obtenus sur ce milieu Morgan Harris dont la composition est donnée ci-dessous. Sur cet ancien milieu seul le pouvoir alcoogène était déterminé.

Composition du milieu de MORGAN HARRIS modifié à 16%

Solution d’ergostérol ; Ergostérol   2,50 g ; Tween 80  400 ml ; Ethanol   600 ml

Dissolution de l’ergostérol dans l’éthanol chauffé à 80°C, puis ajout du Tween 80 et ajustage avec l’éthanol une fois la solution réfroidie.

Extrait de levure  25 g ; KH2PO4   5 g ; Solution d’ergostérol  20 ml ;Acide tartrique   3 g ; Saccharose   266,65 g ; Eau distillée q.s.p.  1000 ml

Contacts

Morvan Coarer
IFV Val de Loire

Marie-Charlotte Colosio
IFV Val de Loire

Joëlle Beguin
IFV Val de Loire



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